La inmunoprecipitación es un inmunoensayo de uso frecuente que se vale de anticuerpos inmovilizados sobre un soporte sólido para aislar, a partir de una muestra compleja, una proteína específica.

Las aplicaciones de la inmunoprecipitación van desde el estudio de presencia o abundancia relativa de una determinada proteína, hasta estudios de funcionalidad e interacción entre proteínas y estudios de modificaciones postraduccionales o de perfiles de expresión.

En esta entrada os traemos algunas claves y aspectos críticos para un ensayo de inmunoprecipitación exitoso.

 

7 claves para un ensayo de inmunoprecipitación exitoso

 

1.- Preparación de la muestra

Antes de llevar a cabo el protocolo de inmunoprecipitación, es necesario extraer los antígenos celulares, por lo que el buffer de lisado resulta un elemento de importancia crítica para obtener una muestra de calidad. Idealmente, este buffer deberá estabilizar la conformación nativa de la proteína, inhibir la actividad enzimática, evitar la desnaturalización del sitio de unión al anticuerpo y asegurar la máxima liberación del antígeno a partir de las células o tejidos de partida.

Para evitar fenómenos de proteólisis, desnaturalización y desfosforilación, una vez extraído el antígeno de la muestra original, éste deberá conservarse en frío. También reduciremos el riesgo de estos fenómenos añadiendo inhibidores de fosfatasas y proteasas al buffer de lisado.

A continuación, el antígeno extraído deberá ser preaclarado mediante purificación con proteína A o G para eliminar otros antígenos no deseados que puedan estar incluidos en la muestra, y que podrían dar lugar a uniones no específicas.

 

2.- Selección de los anticuerpos

Como norma general para los ensayos de inmunoprecipitación, se optará por un anticuerpo policlonal como anticuerpo de captura. La razón principal es que los anticuerpos policlonales se unen a múltiples epítopos de una misma proteína diana, y forman inmunocomplejos más fuertes que los anticuerpos monoclonales.

Podéis ampliar la información sobre los pros y contras de los anticuerpos policlonales y monoclonales en esta entrada.

 

3.- Método de purificación de los anticuerpos

Los anticuerpos policlonales que se utilicen en los ensayos de inmunoprecipitación pueden estar en forma de antisuero, precipitados con sulfato amónico, o purificados por afinidad con proteína A o G. Estos último resultan preferentes ya que al presentar un mayor grado de pureza son más específicos y por lo tanto con ellos se reducirán las uniones no específicas y el ruido de fondo.

 

4.- Título de los anticuerpos

La titulación de los anticuerpos resulta un paso fundamental para optimizar el resultado de nuestro ensayo de inmunoprecipitación. De esta manera evitaremos que el inmunoensayo resulte ineficiente (por falta de anticuerpo) o no específico (por exceso de anticuerpo).

 

5.- Controles

Como siempre, para la correcta interpretación de los resultados, también el los ensayos de inmunoprecipitación resulta esencial incluir una serie de controles tanto positivos como negativos.

 

6.- Pasos de lavado

Los pasos de lavado son críticos para la obtención de un resultado específico. Con ellos eliminaremos las proteínas que no se hayan unido al anticuerpo, evitando así señales inespecíficas.

Es necesario optimizar los pasos de lavado, ya que un exceso de lavado podría llevarnos a una reducción de las uniones antígeno-anticuerpo.

 

7.- Buffers

Además del buffer de lisado del que hemos hablado en el punto 1, hay que seleccionar adecuadamente el reto de buffers que se utilizarán en el ensayo de inmunoprecipitación como el buffer de unión, el de lavado y el de elución.

  • Buffer de unión

Generalmente, las interacciones antígeno-anticuerpo se dan en prácticamente cualquier buffer con un pH cercano al neutro como PBS o TBS, aunque en determinados casos habrá que valorar el uso de buffers de unión más específicos.

 

  • Buffer de lavado

Deberá favorecer unas condiciones en las que se mantenga la interacción con la proteína de interés, pero se evite la unión de proteínas no específicas. Generalmente se parte de buffers con concentraciones salinas y pH fisiológico como PBS o TBS, y se añaden los reactivos que en cada caso sean necesarios.

 

  • Buffer de elución

El buffer de elución deberá tener la fuerza y el pH necesarios para asegurar la correcta elución de las proteínas a partir de los beads.

 

Para terminar esta entrada, os recordamos este post relacionado sobre Solución de problemas en Inmunoprecipitación (IP) que puede resultaros de interés.

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