La técnica de Western Blot es un inmunoensayo ampliamente utilizado en los laboratorios de investigación para identificar, semi-cuantificar y determinar el tamaño de una determinada proteína de interés presente en una muestra biológica.
De manera muy resumida, la técnica de Western Blot consiste en lo siguiente: en primer lugar, las proteínas presentes en la muestra se separan en función de su peso molecular mediante una electroforesis en gel y posteriormente se transfieren a una membrana sólida (nitrocelulosa o PVDF). Al añadir un anticuerpo a esta membrana, este se une de manera específica a la proteína de interés y esta unión se detecta mediante el uso de un anticuerpo secundario conjugado.
Con el objetivo de optimizar este procedimiento, en esta entrada te traemos 5 tips para mejorar tus resultados de Western Blot.
5 tips para mejorar tus resultados de Western Blot
1.- Preparación de la muestra
Como en el resto de inmunoensayos, la correcta preparación de la muestra es el primer paso clave para la obtención de buenos resultados de Western Blot.
En función de diversas variables como que la proteína se vaya a aislar de un cultivo o de un tejido, o si se carga la proteína en su forma nativa o desnaturalizada, hay que seguir algunas pautas específicas a la hora de procesar la muestra de la que partimos.
Te recordamos esta entrada anterior, Preparación de muestras para Western Blot , donde tienes todos los detalles.
2.- Presta especial atención a los lavados
Los pasos de lavado que se suceden a lo largo del protocolo de Western Blot son críticos y pequeños cambios en los mismos pueden suponer una gran diferencia en la calidad d ellos resultados. Por ejemplo, sustituir una solución de detergente de uso habitual Tween-20 por NP-40 puede reducir la aparición de bandas de fondo.
Los lavados tras los pasos de incubación con los anticuerpos son fundamentales y han de ser minuciosos para eliminar el anticuerpo no unido y evitar así la aparición de ruido de fondo.
3.- Elige anticuerpos validados y de calidad
Los anticuerpos son los reactivos más críticos en los ensayos de Western Blot, y su elección debe ser muy cuidadosa para dar con reactivos de gran calidad.
Te dejamos aquí estas entradas anteriores, Cómo validar un anticuerpo monoclonal o policlonal para la transferencia en Western Blot y Cómo elegir los anticuerpos para western blot que te pueden resultar de ayuda en este punto.
También te recordamos nuestro servicio gratuito de búsqueda y selección de anticuerpos donde podemos asesorarte sobre los reactivos que mejor se ajusten a tu ensayo (¡Pruébalo! Es totalmente gratuito y sin compromiso 😉).
4.- Selecciona el buffer de bloqueo más adecuado
La elección del buffer de bloqueo tiene mucho que ver en la obtención de un Wester Blot limpio al bloquear correctamente los sitios de unión inespecífica de los anticuerpos en la membrana e incrementar así la especificidad de los mismos.
El BSA y la leche desnatada en polvo son dos de los agentes de bloqueo de uso más frecuente en Western Blot. Aquí te dejamos las ventajas e inconvenientes de usar cada uno de ellos.
5.- No te olvides de los controles
Como en la mayoría de experimentos, el uso de controles es fundamental para garantizar la calidad y fiabilidad de los resultados.
En el caso del Western Blot, son dos los controles a incluir:
- Controles positivos y negativos para asegurar el correcto funcionamiento de los anticuerpos.
- Controles de carga para asegurar la carga homogénea en todos los pocillos, así como la correcta transferencia del gel a la membrana. Aquí te dejamos unos consejos para seleccionar los controles de carga para Western Blot.
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