Aunque la preparación de muestras para ELISA debe optimizarse siempre en base a la molécula diana y el ensayo específico que tengamos entre manos, existen unas pautas generales para la correcta preparación de las muestras antes de iniciar el experimento.
En esta entrada os traemos una guía general para la preparación de muestras para ELISA, incluyendo aquellas que se utilizan con mayor frecuencia en estos inmunoensayos.
Consejos generales para la preparación de muestras para ELISA
- Los extractos de suero, plasma, células y tejidos suelen utilizarse como norma general diluidos al 50% con el buffer.
- La concentración de proteína en los extractos debe ser de al menos 1 mg/mL.
- La conservación de las muestras se hará en función del periodo previsto de almacenamiento: Refrigeradas (4-8ºC) para periodos inferiores a 48 horas, congeladas (-20ºC) para periodos inferiores a un mes y ultracongeladas (-80ºC) para periodos de hasta 6 meses.
Preparación de muestras para ELISA en función del tipo de muestra
1.- Sobrenadante de cultivo
- Centrifugar el medio celular durante 10 minutos (1500 rpm, 4ºC).
- Utilizar inmediatamente después de la centrifugación o congelar el sobrenadante a -80ºC previamente alicuotado para evitar ciclos de congelación/descongelación.
2.- Lisados celulares
- Lavar las células con PBS.
- Homogeneizar y lisar las células mediante la adición del buffer de lisado.
- Centrifugar el lisado durante 5 minutos (10000g, 4ºC).
- Utilizar inmediatamente después de la centrifugación o congelar el sobrenadante a -80ºC previamente alicuotado para evitar ciclos de congelación/descongelación.
3.- Extractos de tejido
- Lavar el tejido con PBS.
- Cortar en secciones de 1-2mm y mantenerlas en hielo.
- Preparar el buffer de extracción (puede prepararse previamente y almacenarse a 4ºC)
- Añadir 300uL de este buffer de extracción por cada 5mg de tejido y homogeneizar.
- Agitar la muestra durante 1 hora a 4ºC.
- Centrifugar durante 5 minutos (10000g, 4ºC).
- Utilizar inmediatamente después de la centrifugación o congelar el sobrenadante a -80ºC previamente alicuotado para evitar ciclos de congelación/descongelación.
4.-Suero
- Recolectar la sangre en un tubo sin aditivos, y mantenerla a temperatura ambiente durante 30 minutos.
- Centrifugar durante 10 minutos (3000rpm, 4ºC).
- Utilizar inmediatamente después de la centrifugación o congelar el sobrenadante a -80ºC previamente alicuotado para evitar ciclos de congelación/descongelación.
5.- Plasma
- Recolectar la sangre en un tubo con anticoagulante, y mantenerla a temperatura ambiente durante 30 minutos.
- Centrifugar durante 10 minutos (3000rpm, 4ºC).
- Utilizar inmediatamente después de la centrifugación o congelar el sobrenadante a -80ºC previamente alicuotado para evitar ciclos de congelación/descongelación.
6.- Orina
- Recolectar la orina en un recipiente estéril.
- Centrifugar la muestra durante 1 minutos (10000g, 4ºC).
- Utilizar inmediatamente después de la centrifugación o congelar el sobrenadante a -80ºC previamente alicuotado para evitar ciclos de congelación/descongelación.
7.- Saliva
- Recolectar la saliva con un dispositivo adecuado.
- Centrifugar durante 2 minutos (10000g, 4ºC).
- Utilizar inmediatamente después de la centrifugación o congelar el sobrenadante a -80ºC previamente alicuotado para evitar ciclos de congelación/descongelación.
8.- Leche
- Centrifugar la muestra durante 15 minutos (1500g, 4ºC).
- Recolectar la fracción acuosa y volver a repetir el mismo procedimiento 3 veces más.
- Filtrar sobre filtro de 0,2um.
- Utilizar inmediatamente o congelar el sobrenadante a -80ºC previamente alicuotado para evitar ciclos de congelación/descongelación.
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