Los inmunoensayos ELISA son unos de los más versátiles para detectar, identificar y/o cuantificar un determinado antígeno presente en nuestra muestra. Se trata de un ensayo altamente sensible, robusto y relativamente económico, rápido y sencillo de llevar a cabo.
Pero a pesar de la aparente simplicidad de su protocolo, al igual que ocurre con la mayoría de ensayos biológicos, hay veces en las que los resultados no son los esperados.
En esta entrada nos centraremos en 3 problemas comunes al hacer un ELISA, y trataremos de dar algunas pautas para poder resolverlos con éxito.
3 problemas comunes al hacer un ELISA
Algunos de los problemas comunes al hacer un ELISA son la obtención de una señal débil, de baja intensidad o incluso inexistente, la generación de un alto ruido de fondo que distorsione los resultados, o la alta inconsistencia de los resultados entre pocillos.
A continuación os dejamos una relación de Posibles Causas (PC) y Soluciones (S) para estos 3 problemas comunes al hacer un ELISA.
1.- La intensidad de la señal es muy baja o inexistente:
PC: Problemas con el protocolo
S: Puede que el ensayo no se haya preparado correctamente, y para solucionarlo es necesario revisar varios puntos:
- Comprobar que cada paso del protocolo se ha aplicado correctamente
- Comprobar que la longitud de onda y los filtros utilizados en el lector de placas es la apropiada. Para ello se puede repetir el ensayo utilizando un control positivo.
PC: Problemas con el anticuerpo
S: Los anticuerpos son los reactivos más críticos en los ensayos ELISA, y es importante prestar atención a los siguientes puntos:
- Utilizar la dilución recomendada por el fabricante, o en su defecto, optimizar la dilución de anticuerpo a utilizar.
- Asegúrate de utilizar la cantidad suficiente de anticuerpos, probando distintas concentraciones de los mismos hasta identificar la concentración óptima para tu ensayo.
- Asegúrate de que los anticuerpos han estado almacenados correctamente y no han sufrido un exceso de ciclos de congelación/descongelación.
PC: Problemas con el antígeno
S: Cuando se tapizan las placas con el antígeno y al añadir el anticuerpo primario la señal resulta débil o nula, hay que comprobar dos aspectos principales:
- En ocasiones es posible que no se haya adherido suficiente cantidad de antígeno a la placa, prueba añadiendo más cantidad.
- En el caso de antígenos peptídicos, es preciso conjugarlos previamente a una proteína carrier de gran tamaño con el fin de facilitar el reconocimiento del epítopo por parte del anticuerpo.
PC: Problemas con los reactivos
S: Asegúrate siempre de que:
- Los reactivos estén a temperatura ambiente antes de comenzar el ensayo
- Comprueba las fechas de caducidad
- Comprueba que se han preparado correctamente y se han ido añadiendo en el orden correspondiente.
- Asegúrate de que no interfieran con otros buffers o compuestos presentes en la muestra como acida sódica, EDTA, etc.
- Evita mezclar reactivos provenientes de distintos kits.
PC: Tiempos y temperatura de incubación bajos
S: Asegúrate de incubar las muestras durante el tiempo especificado por el fabricante y optimiza la temperatura de incubación para tu ensayo. Recuerda que los reactivos deben estar a temperatura ambiente antes de comenzar el ensayo.
PC: Condiciones de almacenamiento
S: Almacena los reactivos según sus especificaciones, teniendo en cuenta que todos los reactivos pueden no necesitar los mismos requisitos de almacenamiento.
2.- El ruido de fondo es muy alto
PC: Problemas con el anticuerpo
S: Respecto a los anticuerpos, pueden darse varios casos:
- Que la concentración de anticuerpo empleada sea demasiado alta. Esto se resolverá reduciendo su concentración, o llevando a cabo un ensayo de optimización para determinar la concentración idónea.
- Que haya problemas de reactividad cruzada, para lo que se deberá utilizar un control negativo.
- Uniones no específicas donde el anticuerpo esté detectando otras moléculas además del antígeno diana. La solución pasa por la utilización de anticuerpos purificados por afinidad y la utilización de los buffers de bloqueo adecuados.
PC: Problemas con los reactivos
S: Respecto a los distintos reactivos, hay que asegurarse de que:
- Se añade la solución stop para evitar un sobre desarrollo de la reacción.
- El reactivo de detección se ha diluido adecuadamente, y de ser así, volver a realizar el ensayo con una dilución aún mayor.
- Se han utilizado los buffers de bloqueo adecuados y el tiempo de bloqueo ha sido suficiente.
PC: Problemas en la incubación
S: En el caso de obtener alto ruido de fondo puede que sea necesario reducir la temperatura de incubación. Por otro lado, es preciso asegurar que la incubación del sustrato se lleva a cabo en condiciones de oscuridad.
PC: Lavados insuficientes
S: Lavar cuidadosamente el fondo de la placa y repetir la lectura.
3.- La variación de resultados entre pocillos es muy alta
PC: Incubación inadecuada
S: Respecto al paso de incubación, es importante:
- No apilar las placas durante el proceso para asegurar que la temperatura se distribuya de manera uniforme.
- Asegurarse de que no quedan burbujas en el interior de los pocillos antes de proceder a la incubación.
PC: Lavado inadecuado
S: Asegúrate de lavar a fondo todos los pocillos, ya que un lavado no homogéneo podría derivar en un alto coeficiente de variación.
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