El Western Blot (WB) es el método basado en anticuerpos más frecuentemente utilizado en laboratorios de investigación biológica. Se trata de una herramienta esencial para detectar la presencia o ausencia de una determinada proteína en una muestra, comparar la abundancia relativa de diversas proteínas, estudiar interacciones proteína-proteína o monitorizar las modificaciones postraduccionales, entre otras.
Aunque es una técnica relativamente sencilla y con multitud de aplicaciones, pueden surgir dificultades a la hora de separa proteínas de tamaños parecidos como pueden ser las distintas isoformas de una misma proteína o determinadas modificaciones postraduccionales que provocan cambios mínimos en el peso molecular como es el caso de las fosforilaciones.
En esta entrada veremos 5 trucos para que separar proteínas de tamaño similar en Western Blot deje de ser un problema.
5 trucos para separar proteínas de tamaño similar en Western Blot
1.- Utiliza geles de baja densidad
En la técnica de Western Blot, las proteínas de una muestra se separan en función de su tamaño: aquellas con un mayor peso molecular se moverán más despacio a través del gel, mientras que las de menor peso molecular migrarán a mayor velocidad.
La velocidad de migración de las proteínas depende además del tamaño de poro del gel que a su vez vendrá determinado por el porcentaje de poliacrilamida. Por lo tanto, al utilizar un gel con un bajo porcentaje de poliacrilamida (gel de baja densidad) será más fácil separar proteínas de tamaño similar en Western Blot con una mayor resolución.
La concentración de poliacrilamida deberá ser menor cuanto mayor sea el peso molecular de las proteínas que queremos separar. Os dejamos algunos ejemplos como referencia:
- Proteínas de más de 100kDa: 8% poliacrilamida
- Proteínas entre 30 y 100kDa: 10% poliacrilamida
- Proteínas entre 10 y 30kDa: 12% poliacrilamida
- Proteínas de menos de 10kDa: 15% poliacrilamida
2.- Utiliza geles de gradiente
Los geles de gradiente son muy útiles para separar proteínas de tamaño similar en Western Blot con una mayor resolución, siempre y cuando el tamaño de las mismas no sea demasiado pequeño (menos de 10kDa).
3.- Western Blot fluorescente multiplexado
El multiplexado, utilizando anticuerpos monoclonales de diferentes isotipos para detectar múltiples bandas en un mismo gel, es una técnica muy útil para detectar modificaciones postraduccionales que no modifican significativamente el peso molecular de la proteína diana como las fosforilaciones, acetilaciones, etc.
4.- Western Blot bidimensional
El Western Blot en 2D permite separar las proteínas no solo en base a su tamaño sino también a su punto isoeléctrico, por lo que puede resultar de ayuda a la hora de separar proteínas de tamaño similar en Western Blot, siempre y cuando hablemos de proteínas con puntos isoeléctricos distintos.
5.- Aumenta el tamaño y /o el tiempo del gel
Para finalizar, cabe también mencionar que realizar el Western Blot en geles de mayor tamaño y aumentar el tiempo en el que se deja correr el gel son dos factores que pueden incrementar la resolución de proteínas de tamaños similares.
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