La técnica de Inmunoprecipitación (IP), es un inmunoensayo comúnmente utilizado para estudiar proteínas en solución, mediante el uso de anticuerpos con alta afinidad por las mismas.

En este post os traemos una breve guía con consejos para la solución de problemas en Inmunoprecipitación (IP) en base a las causas más habituales. Pero antes, repasemos cuáles son los factores clave en un ensayo de Inmunoprecipitación (IP).

Factores clave en Inmunoprecipitación (IP)

  • MUESTRA: la correcta preparación de la muestra es uno de los factores clave para el éxito del inmunoensayo. A la hora de obtener el antígeno a partir de células o tejidos, es preciso utilizar un buffer de lisado adecuado que incluya inhibidores de proteasas (para evitar la degradación de los antígenos), así como un desincrustante (para asegurar que las células liberan el antígeno de interés).

 

  • ANTICUERPOS: una de las características fundamentales que hay que buscar en los anticuerpos a la hora de llevar a cabo cualquier tipo de inmunoensayo es la especificidad. En la inmunoprecipitación, además, la afinidad de los anticuerpos se convierte en otro de los factores clave. Te recordamos esta entrada donde puedes ver las ventajas e inconvenientes del uso de anticuerpos monoclonales o policlonales en función del tipo de inmunoensayo.

 

  • BEADS O MICROESFERAS: para inducir la inmunoprecipitación, los anticuerpos deben unirse a un sustrato sólido en forma de beads o microesferas. Estas pueden ser de agarosa o magnéticas, y la elección dependerá de las necesidades individuales de cada ensayo. Por citar alguna de las ventajas, cabe destacar la alta capacidad de acoplamiento que presentan las microesferas de agarosa, mientras que las beads magnéticas destacan por su gran capacidad de unión a proteínas de elevado tamaño.

 

Solución de problemas en Inmunoprecipitación (IP)

Los problemas más frecuente en los ensayos de Inmunoprecipitación suelen traducirse en alguno de los siguientes aspectos: alto ruido de fondo o incapacidad para detectar la proteína diana.

A continuación os detallamos las posibles causas (PC) así como los consejos o soluciones (S) para solventarlos:

1.- Alto ruido de fondo

PC: Lavado incompleto

  • S: Lavar bien tras cada uno de los pasos, tapando el tubo e invirtiéndolo varias veces antes de centrifugar.

PC: Unión de proteínas no específicas a las beads

  • S1: Asegurarse de que las beads han sido correctamente bloqueadas con BSA.
  • S2: Cargar una menor cantidad de muestra sobre las beads.

PC: Los anticuerpos no son lo suficientemente específicos

  • S: Utilizar anticuerpos purificados por afinidad frente al antígeno.

PC: Exceso de anticuerpo que da lugar a uniones no específicas

  • S1: Revisar la concentración de anticuerpo recomendada en la hoja técnica.
  • S2: Probar a utilizar una cantidad menor de anticuerpo.

PC: Degradación del antígeno durante la inmunoprecipitación

  • S: Asegurarse de que se han añadido inhibidores de proteasas al buffer de lisado.

PC: Las proteínas no son solubles en el detergente

  • S: Retirar el sobrenadante inmediatamente después de la centrifugación.

PC: Formación de agregados de proteínas

  • S: Centrifugar para eliminar los agregados.

PC: Tiempo de incubación demasiado largo

  • S: Reducir los tiempos de incubación.

 

2.- Problemas para detectar la proteína diana

PC: La proteína diana no está presente en la muestra

  • S1: Comprobar el perfil de expresión de la proteína diana para asegurarse de que se expresará en las células de la muestra.
  • S2: Preparar lisados frescos (evitar el uso de lisados congelados).
  • S3: Utilizar inhibidores de proteasas en el buffer de lisado.

PC: La proteína diana está presente en muy baja concentración

  • S: Incrementar la cantidad de lisado utilizado, teniendo en cuenta que esto puede resultar en un incremento de uniones no específicas.

PC: Cantidad de anticuerpo insuficiente

  • S1: Comprobar que se está utilizando la concentración de anticuerpo recomendada en la hoja técnica.
  • S2: Incrementar la concentración de anticuerpo.

PC: El anticuerpo no se ha unido a las beads

  • S: Asegurarse de que se están utilizando las beads adecuadas en base al isotipo del anticuerpo empleado. (Recuerda este post sobre Isotipos e isotipado de anticuerpos).

PC: Buffer de lisado inadecuado

  • S: Comprobar en la hoja técnica del anticuerpo si este reconoce el antígeno nativo o desnaturalizado, y adecuar el buffer de lisado.

PC: Lavados demasiado severos

  • S1: Reducir el número de lavados.
  • S2: Reducir la concentración de sales y detergentes en el buffer de lavado.

PC: El anticuerpo no presenta suficiente afinidad por el antígeno

  • S: Si el anticuerpo se une de forma débil al antígeno, es difícil que esta unión se mantenga durante los pasos de incubación y lavado. Con el fin de aumentar la afinidad se recomienda el uso de anticuerpos policlonales. (Recuerda esta entrada sobre las Diferencias entre anticuerpos monoclonales y policlonales).

PC: Las proteínas no pueden ser eluídas de las beads

  • S: Cambiar el buffer de elución atendiendo a sus componentes, salinidad, concentración, pH, etc.

PC: Exceso de proteínas no específicas en la muestra que compiten con el antígeno diana

  • S: Centrifugar la muestra para eliminar las proteínas insolubles y los fragmentos de membrana antes de añadir los anticuerpos.

 

 

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