La inmunohistoquímica (IHC) es una técnica que se aplica de manera común tanto en el ámbito de la investigación como en el diagnóstico clínico. El uso de anticuerpos sobre una sección de tejido permite detectar las proteínas de interés de manera específica, para posteriormente determinar tanto la localización como la abundancia de las mismas mediante microscopía.
Aunque, en principio, el protocolo pueda parecer relativamente sencillo de aplicar, requiere optimizar algunos parámetros que resultarán fundamentales para la buena resolución de cada ensayo. El mismo protocolo puede funcionar perfectamente con un anticuerpo, pero no así con otros; y algunos anticuerpos pueden necesitar ajustes específicos en alguno de los pasos del procedimiento.
En esta entrada recogemos algunas consideraciones clave para optimizar los resultados y solucionar problemas en Inmunohistoquímica (IHC).
Cómo solucionar problemas en Inmunohistoquímica (IHC)
A continuación os detallamos las posibles causas (PC) que pueden dar lugar a resultados ambiguos o erróneos, así como los consejos o soluciones (S) para solventarlos:
1.- AUSENCIA DE TINCIÓN
— Antígenos —
PC: Ausencia de antígeno, o presencia en muy baja cantidad
- S1: Analizar la expresión de la proteína mediante hibridación in situ.
- S2: Incluir un paso de amplificación de la señal de detección en el protocolo.
- S3: Incrementar la concentración del anticuerpo.
PC: Alteración de los epítopos durante el paso de fijación
- S: Intentar restaurar la inmunoreactividad mediante técnicas de recuperación de antígenos.
PC: Recuperación del antígeno ineficaz
- S1: Incrementar el tiempo de tratamiento.
- S2: Cambiar la técnica de recuperación.
PC: La proteína está localizada en el núcleo y el anticuerpo no puede penetrar
- S: Añadir agentes permeabilizantes al buffer de bloqueo y al buffer de dilución del anticuerpo.
— Anticuerpos —
PC: Los anticuerpos han perdido actividad
- S1: Seguir las instrucciones del fabricante en cuanto a los criterios de almacenamiento del anticuerpo. (Puedes encontrar algunos consejos para almacenar los anticuerpos correctamente en esta entrada.)
- S2: Incluir siempre controles positivos para descartar el mal funcionamiento del anticuerpo.
PC: Incompatibilidad entre el anticuerpo primario y el secundario
- S: El anticuerpo secundario debe ir dirigido frente a la especie en la que fue generado el anticuerpo primario. (Aquí puedes consultar una Guía para seleccionar los anticuerpos secundarios.)
PC: Anticuerpo primario incorrecto
- S: Seleccionar un anticuerpo específico frente al antígeno de interés. Hay que tener en cuenta, que en Inmunohistoquímica el anticuerpo debe reconocer la conformación nativa del antígeno, por lo que conviene contrastar en la hoja técnica que ha sido validado para su uso en esta aplicación.
— Preparación de la muestra —
PC: Fijación inadecuada del tejido
- S1: Aumentar el tiempo de fijación.
- S2: Probar con un fijador diferente.
PC: Sobre-fijación del tejido
- S: Reducir la duración de la inmersión o de los pasos post-fijación.
— Reactivos —
PC: Los reactivos se han añadido en un orden incorrecto y/o se han omitido pasos
- S: Revisar cuidadosamente el procedimiento que se ha llevado a cabo.
2.- TINCIÓN DÉBIL DE LA PROTEÍNA DIANA
— Antígenos —
PC: Inadecuada recuperación del antígeno
- S1: Variar las condiciones de recuperación.
- S2: Cambiar el método de recuperación
PC: Alteración de la carga electrostática del antígeno
- S: Ajustar el pH o la concentración catiónica del buffer del anticuerpo.
— Anticuerpos —
PC: Baja reactividad del anticuerpo primario
- S1: Asegurarse de que el pH del diluyente del anticuerpo está dentro del rango óptimo especificado para la unión del anticuerpo (pH 7-8).
- S2: Asegurarse de que el anticuerpo ha estado almacenado según las indicaciones del fabricante.
- S3: Incrementar la concentración del anticuerpo primario y/o el tiempo de incubación.
PC: Inhibición del anticuerpo secundario
- S1: Reducir la concentración del anticuerpo secundario. (Mientras que concentraciones altas de anticuerpo secundario pueden aumentar la tinción del fondo, las concentraciones extremadamente altas pueden llegar a tener el efecto contrario, reduciendo la detección del antígeno).
- S2: Si el diluyente contiene anticuerpos que neutralizan al antígeno, estos bloquearán la unión del anticuerpo secundario. Eliminar los anticuerpos neutralizantes o cambiar el diluyente.
— Preparación de la muestra —
PC: Método de fijación inadecuado
- S1: Incrementar el tiempo de fijación.
- S2: Probar con un método de fijación distinto.
— Reactivos —
PC: Reactividad enzima – sustrato
- S1: Cambiar el diluyente de la enzima.
- S2: Preparar de nuevo el sustrato a un pH adecuado.
3.- ALTO RUIDO DE FONDO
— Anticuerpos —
PC: El anticuerpo secundario presenta reactividad cruzada o uniones no específicas
- S1: Tratar el tejido con suero normal de la especie que el anticuerpo secundario.
- S2: Usar anticuerpo pre-adsorbido frente a la especie de la muestra.
PC: Inespecificidad del anticuerpo primario
- S1: Reducir la concentración del anticuerpo primario
- S2: Incrementar la concentración del buffer de bloqueo y reducir el tiempo entre el bloqueo y la adición del anticuerpo primario.
- S3: Utilizar un anticuerpo primario diferente.
PC: Alta concentración de anticuerpo primario o secundario
- S: Titular el anticuerpo para determinar la concentración óptima de trabajo.
PC: Interacciones hidrofóbicas entre el anticuerpo y otras proteínas presentes en el tejido
- S: Reducir la fuerza iónica del diluyente del anticuerpo.
PC: Tiempo o temperatura de incubación demasiado elevados
- S: Reducir el tiempo y/o la temperatura de incubación.
PC: Lavado inadecuado de las secciones
- S: Lavar al menos tres veces entre cada uno de los pasos del procedimiento.
— Preparación de la muestra —
PC: Presencia en el tejido de enzimas endógenas (peroxidasas y/o fosfatasas)
- S1: Bloquear las peroxidasas con peróxido de hidrógeno en metanol antes de la incubación con el anticuerpo primario.
- S2: Inhibir la acción de las fosfatasas endógenas con levamisol.
PC: Presencia de biotina endógena
- S: Bloquear la actividad de la biotina endógena mediante reactivo de bloqueo avidina/biotina antes de la incubación con el anticuerpo primario.
PC: Las secciones de tejido se han secado
- S: Evitar que el tejido se seque durante el proceso de tinción.
La técnica Inmunohistoquímica (IHC), al igual que otros inmunoensayos , implica diversos pasos que no pueden ser optimizados de manera universal, teniendo que ajustar determinadas condiciones para cada uno de los ensayos, lo que se traduce en multitud de variables que pueden incidir en que los resultados sean los esperados.
Esperamos que estos tips os hayan resultado de utilidad para solucionar problemas en Inmunohistoquímica (IHC). Y si aún tenéis alguna duda, no dudéis en contactar con nosotros.
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