El bloqueo es un paso necesario que ha de llevarse a cabo en distintos inmunoensayos como ELISA, Western Blot (WB), Inmunohistoquímica (IHC), etc. El buffer de bloqueo rellena los espacios que no han sido ocupados por las proteínas o los anticuerpos inmovilizados en la fase sólida y con la función de prevenir uniones no específicas de los anticuerpos, y evitar así falsos positivos y/o problemas de ruido de fondo.
Para elegir el buffer de bloqueo más apropiado, debemos fijarnos principalmente en tres aspectos:
- Los anticuerpos
- La proteína de interés
- El sistema de detección.
Tipos de buffer de bloqueo
A continuación resumimos los pros y contras de algunos de los agentes de bloqueo más frecuentemente utilizados:
1.- Leche desnatada en polvo
2.- BSA: Albúmina de suero bovino
3.- Gelatina de pescado
4.- Suero completo
5.- Caseína purificada
6.- Agentes bloqueantes comerciales patentados
7.- Polivinilpirrolidona (PVP)
Tips para elegir el buffer de bloqueo
Una vez analizados los pros y contras de los distintos agentes de bloqueo, conviene tener en cuenta algunos aspectos antes de tomar la decisión final acerca del agente a utilizar:
- Un bloqueo insuficiente puede traducirse en un alto ruido de fondo, y por lo tanto, en una reducción del ratio señal/ruido.
- Un bloqueo excesivo puede producir pérdida de proteína y/o enmascarar las interacciones antígeno-anticuerpo.
- Los reactivos de detección pueden dar lugar a reacciones cruzadas con algunos buffer de bloqueo.
- Ningún buffer de bloqueo es idóneo para cualquier combinación antígeno-anticuerpo. La elección del bloqueante puede afectar a la especificidad del anticuerpo, y en consecuencia, dar lugar a uniones inespecíficas.
- El ensayo empírico es fundamental para determinar el agente de bloqueo más apropiado en cada caso, debiendo prestar especial atención a:
- Monitorizar el ruido de fondo (control negativo) y la intensidad de la señal (control positivo) con diferentes buffer de bloqueo.
- Elegir el buffer de bloqueo que tenga un menor ratio señal/ruido.
- Asegurarse de que no existen sustancias en la composición del reactivo de bloqueo que interfieran con el ensayo.
En definitiva, los buffer de bloqueo permiten mejorar la sensibilidad de los ensayos reduciendo el ruido de fondo, aumentando el ratio señal/ruido y facilitando la unión específica del anticuerpo primario.
Esperamos que estos tips os hayan resultado de utilidad para elegir el agente bloqueante más adecuado para vuestros inmunoensayos.
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