La Inmunofluorescencia (IF) es una técnica de gran utilidad para la detección y localización de antígenos celulares mediante el uso de anticuerpos marcados con fluorocromos. Aunque el procedimiento es relativamente sencillo, incluyendo los pasos de fijación y permeabilización de las muestras, bloqueo e incubación con los anticuerpos marcados,  en muchos casos el éxito del ensayo puede depender del correcto ajuste de determinadas variables durante el proceso.

En esta entrada recogemos algunos consejos que te permitirán optimizar tus experimentos de Inmunofluorescencia (IF).

5 tips para Inmunofluorescencia (IF)

1.- Preparación de la muestra: fijación y permeabilización

Estos pasos son fundamentales para que los anticuerpos puedan acceder hasta el antígeno diana, y la optimización de las variables resulta crítica para no afectar a la integridad celular y a la del propio antígeno.

  • Fijación

El objetivo de este proceso es preservar al máximo la morfología celular respecto a su estado nativo. Para ello, existen dos grandes grupos de reactivos de fijación, cada uno con sus ventajas e inconvenientes: los aldehídos y los solventes orgánicos.

  • Aldehidos: preservan correctamente la morfología celular, y están especialmente recomendados para la visualización de proteínas de membrana. En contrapartida, la antigenicidad de la proteína diana puede verse reducida.
  • Solventes orgánicos: preservan correctamente la arquitectura celular, y añaden la ventaja de no requerir un posterior paso de permeabilización. Sin embargo, presentan algunos inconvenientes como que durante el proceso de fijación se eliminan gran cantidad de lípidos y pequeñas moléculas solubles.

 

  • Permeabilización

Este paso solo será necesario en el caso de haber utilizado aldehídos como agente de fijación.

 

2.- Buffers y agentes de bloqueo

  • Buffers

Aunque el buffer de elección suele ser el PBS, ya que al ser isotónico no altera la estructura celular y mantiene el pH en niveles cercanos a los fisiológicos, en algunas ocasiones en las que se obtiene una señal débil, será necesario probar otras alternativas con diferentes composiciones iónicas de calcio, magnesio y potasio.

  • Agentes de bloqueo

El paso de bloqueo es necesario para evitar uniones no específicas de los anticuerpos. Aunque el más habitual es el BSA, en determinados casos conviene probar otras alternativas como el suero bovino fetal, caseína o gelatina para intentar optimizar la señal.

 

3.- Anticuerpos

Los anticuerpos son uno de los reactivos más críticos en los experimentos de inmunofluorescencia.

  • Especificidad

Los anticuerpos empleados en ensayos de inmunofluorescencia deben ser altamente específicos frente al antígeno de interés, aunque esto no implica necesariamente que deban ser monoclonales.

Por ejemplo, en aquellos casos que requieran una alta precisión como el marcaje del extremo c-terminal de una determinada proteína, se recomienda el uso de anticuerpos monoclonales. Sin embargo, en los casos en los que se requiera una mayor afinidad como cuando la proteína está presente en muy bajas concentraciones, los anticuerpos policlonales serán los más indicados.

Recuerda este post sobre las diferencias entre anticuerpos monoclonales y policlonales para más información.

  • Dilución 

Para optimizar la tinción, siempre es recomendable titular los anticuerpos mediante diluciones seriadas, para optar por la concentración que permita mejorar la intensidad de la señal, manteniendo bajo el ruido de fondo.

  • Anticuerpos secundarios 

En caso de llevar a cabo un experimento de Inmunofluorescencia indirecta (IIF), deberemos prestar atención también a la elección de los anticuerpos secundarios (recuerda esta guía para seleccionar los anticuerpos secundarios). Estos anticuerpos deberán reaccionar no solo frente a la especie en la que fue originado el anticuerpo primario, sino también frente a su isotipo.

Con el fin de reducir al máximo la reactividad cruzada, especialmente en experimentos multicolor donde se utilizan simultáneamente varios anticuerpos primarios y sus correspondientes secundarios, se recomienda llevar a cabo un paso adicional de pre-adsorción de esos anticuerpos secundarios, haciéndolos pasar por una columna donde se hayan inmovilizado previamente las proteínas séricas de aquellas especies con las que exista riesgo de reacción cruzada.

4.- Selección de fluorocromos

Para seleccionar el fluorocromo que mejor se ajuste a nuestro experimento, debemos valorar varios factores:

  • Características y funcionalidades del microscopio: debemos asegurarnos de que los fluorocromos seleccionados pueden ser excitados y detectados de forma óptima.
  • Características de los fluorocromos

Coeficiente de extinción: cuanto más alto sea el coeficiente de extinción, más brillante será la señal que emita.

Rendimiento cuántico: es un indicador del rendimiento del proceso de fluorescencia, por lo tanto, lo ideal sería optar por fluorocromos con alto rendimiento cuántico.

Susceptibilidad al fotoblanqueo: se recomienda el uso de fluoróforos fotoestables, con el fin de que la intensidad de la señal no se vea reducida por un proceso de destrucción fotoquímica.

Contratinción: es necesario asegurarse de que el espectro del fluorocromo es distinto al de la contratinción que facilitará el contraste del fondo.

  • Experimentos de Inmunofluorescencia multicolor: en estos casos, los espectros de emisión de los fluoróforos deben ser lo más estrechos posibles con el fin de evitar solapamientos. Los fluoróforos más brillantes deberán utilizarse para la detección de los antígenos con menor nivel de expresión en la muestra.
  • Controles: deberán incluirse controles para monitorizar la señal de autofluorescencia del fondo y la especificidad de los anticuerpos primarios y secundarios, entre otros.

 

5.- Contratinción

Para contextualizar la señal específica de nuestra muestra, es necesario el uso de contratinciones frente a estructuras celulares como el núcleo, el citoesqueleto o la membrana plasmática. A diferencia de los anticuerpos, las contratinciones no reaccionan entre ellas y pueden incubarse al mismo tiempo en un único paso.

 

Como hemos visto, existen varios métodos para fijar, permeabilizar y teñir las células, presentando cada uno de ellos sus ventajas e inconvenientes. El protocolo de Inmunofluorescencia (IF) deberá optimizarse en cada caso concreto, atendiendo a estos criterios, y en base a la diana concreta que pretendamos analizar y a la localización de la misma.

 

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