A la hora de transferir proteínas de gran tamaño en Western Blot, la eficiencia de esta técnica puede verse comprometida por factores como la proporción SDS-metanol en el buffer de transferencia o el porcentaje del gel, entre otros.
En esta entrada os traemos 7 consejos para que el reto de transferir proteínas de gran tamaño en Western Blot resulte todo un éxito.
7 tips para transferir proteínas de gran tamaño en Western Blot
1.- Gel con menor porcentaje de acrilamida
Las proteínas de gran tamaño tienden a moverse de una manera más eficiente y ofrecen una mayor resolución en un gel con menor porcentaje de acrilamida, ya que este es inversamente proporcional al tamaño de poro que se obtendrá. A menor porcentaje de acrilamida mayor tamaño de poro, lo que se traduce en mayor facilidad para la movilidad de proteínas de gran tamaño.
La contrapartida es que estos geles resultan menos consistentes, y por lo tanto, más difíciles de manipular, por lo que es imprescindible un manejo cuidadoso de los mismos.
El porcentaje recomendado para transferir proteínas de gran tamaño en Western Blot oscila entre un 6-8%.
En el caso de que se quieran identificar proteínas de alto y bajo peso molecular en una misma muestra, puede recurrirse a un gel en gradiente.
2.- Incrementar la concentración de SDS en el buffer de transferencia
Las proteínas de gran tamaño son propensas a precipitar en el gel impidiendo su correcta transferencia. La adición de SDS en una concentración del 0.1% permitirá dotar a las proteínas de una carga negativa uniforme, facilitando así la transferencia de las mismas del gel a la membrana.
3.- Reducir la concentración de metanol en el buffer de transferencia
La reducción de la concentración de metanol en el buffer de transferencia también ayuda a evitar que las proteínas de gran tamaño precipiten. Esto ocurre por dos motivos:
- El metanol dificulta la unión del SDS a las proteínas, por lo que a menor concentración de metanol mayor unión del SDS a las proteínas, y por lo tanto, mayor facilidad para la transferencia de las mismas.
- El metanol hace que el gel se contraiga, por lo que reduciéndolo conseguiremos que este se dilate, favoreciendo la transferencia de proteínas de gran tamaño.
La concentración de metanol puede reducirse hasta una concentración final del 10% o incluso inferior.
4.- Incrementar el tiempo de transferencia
El hecho de transferir proteínas de gran tamaño en Western Blot puede llevar más tiempo que aquellas de bajo peso molecular, debido a que su volumen compromete la movilidad de las mismas. Alargar el tiempo de transferencia en estos casos mejorará la eficiencia de la transferencia.
5.- Tipo de transferencia
La transferencia húmeda resulta más eficiente a la hora de transferir proteínas de gran tamaño en Western Blot que la transferencia semiseca, ya que en este último caso no es viable incrementar el tiempo de transferencia como indicábamos en el punto anterior.
6.- Tipo de membrana
Aunque para transferir proteínas de gran tamaño en Western Blot pueden utilizarse tanto membranas de nitrocelulosa como de PVDF, es uso de las segundas puede favorecer el resultado ya que no requieren la presencia de metanol en el buffer de transferencia, lo que ayuda a evitar la precipitación de estas proteínas.
Al igual que ocurre con el gel, las proteínas de gran tamaño se moverán más fácilmente por poros de mayor tamaño, por lo que deben evitarse las membranas con tamaño de poro inferior a 0.2um.
7.- Utilizar buffers de transferencia comerciales optimizados
En los casos en los que no se consiga dar con la composición adecuada del buffer de transferencia, se puede recurrir a buffers comerciales ya optimizados para incrementar la eficiencia a la hora de transferir proteínas de gran tamaño en Western Blot.
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