No es extraño que algunos anticuerpos que dan excelentes resultados en técnicas como ELISA, WB, IP… fallen a la hora de aplicarlos en técnicas de inmunohistoquímica, resultando inespecíficos (tinción del fondo) o produciendo señales muy débiles o nulas. Esto se debe principalmente a que los reactivos que se emplean en la fijación de los tejidos (p.e. formaldheido) así como la parafina en la que posteriormente se embeben, y que pueden producir alteraciones en el antígeno presente en la muestra.

¿Cómo podemos resolver este problema?

La clave está en la validación de los anticuerpos. El método utilizado para probar su funcionalidad resulta crucial para la obtención de unos resultados óptimos en inmunohistoquímica.

Uno de los procesos de validación más estrictos y que garantiza al 100% el buen funcionamiento de los anticuerpos utilizados en inmunohistoquímica es el seguido por la norteamericana LifeSpan BioSciences, Inc. Este proceso se basa en una serie de directrices que resumimos a continuación:

  1. Elegir el anticuerpo: La inmunohistoquímica requiere el uso de un anticuerpo secundario. Con la finalidad de reducir al máximo el fondo, el anticuerpo primario debería haber sido producido en una especie distinta a la del tejido diana, evitando de esta manera la detección de inmunoglobulinas endógenas por el secundario.En el caso de que esto no sea posible y el anticuerpo primario haya sido producido en la misma especie que el tejido a estudiar, evitaremos este mismo problema si dicho anticuerpo contiene un tag y podemos hacer uso de un secundario anti-tag en lugar de un anti-Ig de la especie en cuestión.
  2. Determinar la especificidad del anticuerpo: En el caso de anticuerpos para cuya obtención se haya utilizado un péptido como antígeno, es necesario asegurarse de que la secuencia de aminoácidos seleccionada es única para la proteína diana y que no se repite, por ejemplo, en proteínas de la misma familia. Podemos descartar homologías mediante un BLAST.En el caso de que el antígeno empleado haya sido una proteína, haremos una inmunohistoquímica o inmunocitoquímica sobre líneas celulares que sobre-expresen la proteína diana, así como líneas celulares que nos sirvan de control negativo.
  3. Fijación del tejido: En el caso de tejidos frescos y/o congelados, los antígenos se mantienen en un estado similar al nativo, pero al fijarlos con preservantes como la formalina, paraformaldehido, alcohol, ácido pícrico…, con frecuencia se desnaturalizan y repliegan en estructuras que no pueden ser reconocidas por el anticuerpo generado frente a la proteína nativa. Es importante atender al tipo de anticuerpos que se utilizará para la Inmunohistoquímica:
    • Anticuerpos monoclonales para inmunohistoquímica: es muy difícil que un monoclonal frente a la forma nativa reconozca esa proteína sobre un tejido fijado. En algunos casos, la conformación del antígeno puede recuperarse utilizando reactivos como la Proteinasa K, aunque esto sólo funcionará en aproximadamente la mitad de los casos. Como contrapartida, si conseguimos un monoclonal que reconozca la proteína fijada, tendremos asegurado un fondo prácticamente inexistente.
    • Anticuerpos policlonales para inmunohistoquímica: la probabilidad de éxito de un policlonal supera con creces a la de un monoclonal, pero en consecuencia, también producirá un mayor fondo inespecífico.
  4. Validación del tejido: Las secciones se validan previamente frente a anticuerpos que sirvan como controles positivos (anti citoqueratinas, vimentina, CD31, CD3, CD20 o GFAP), para garantizar que se mantiene la antigenicidad una vez hecha la fijación.
  5. Validación Inmunohistoquímica: Se prueba cada anticuerpo (en al menos 4 diluciones/concentraciones) sobre un tissue array formado por multi-tejidos fijados con formalina y embebidos en parafina. Este análisis permite obtener una visión general del comportamiento del anticuerpo en cuanto a sensibilidad, especificidad frente a distintos tipos celulares y nivel de fondo inespecífico.

Siguiendo este exhaustivo proceso de validación, la funcionalidad del anticuerpo en inmunohistoquímica queda garantizada. Desde aquí te proponemos una lista de anticuerpos para inmunohistoquímica (para ver la lista pincha aquí), con más de 11.000 referencias que ya han sido validados según estas directrices, y que garantizan por lo tanto una satisfacción del 100%.

Fuente imagen: Flickr

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