Los anticuerpos son una de las herramientas de uso más extendido en los laboratorios de investigación para identificar, bloquear o incluso aislar diversas moléculas. Debido a la especificidad que se les presupone, es fundamental validar los anticuerpos para el uso en cada una de las técnicas en las que se vayan a aplicar, ya que, como hemos visto en otras ocasiones, un anticuerpos puede resultar muy específico por ejemplo en un inmunoensayo ELISA, y sin embargo dar una señal muy débil en otro tipo de ensayos como el Western Blot.
Validar los anticuerpos implica testar los siguientes aspectos:
- Especificidad del anticuerpo en la técnica seleccionada
- Afinidad por el antígeno
- Reproducibilidad entre ensayos
En esta entrada recopilamos algunos tips para orientarte a la hora de validar los anticuerpos y definir su especificidad.
Principales problemas con los Anticuerpos, ¿cómo resolverlos?
Los problemas que más habitualmente se derivan del uso de anticuerpos son la reactividad cruzada, la variabilidad entre lotes y su aplicación en una técnica incorrecta.
1.- REACTIVIDAD CRUZADA
- Problema: El anticuerpos no solo se une al antígeno diana, sino también a otras proteínas presentes en la muestra.
2.- VARIABILIDAD ENTRE LOTES
- Problema: Es más frecuente en el caso de los anticuerpos policlonales, ya que un mismo anticuerpo producido en distintos animales, podría funcionar de manera ligeramente diferente.
3.- APLICACIÓN ERRÓNEA
- Problema: Las diferentes técnicas y condiciones experimentales en las que se lleva a cabo cada una de ellas pueden llegar a modificar el plegamiento de la proteína diana, y en consecuencia, su capacidad para unirse al anticuerpo.
Para evitar cualquiera de estos problemas, es de vital importancia validar los anticuerpos antes de su uso.
Pero, ¿cómo hacerlo? Presta atención a los ensayos que enumeramos a continuación.
Ensayos para validar los anticuerpos
Los anticuerpos pueden validarse mediante multitud de ensayos funcionales, cada uno de los cuales presenta sus ventajas e inconvenientes:
ELISA
- Pros:
- Ensayo cuantitativo, permite confirmar la sensibilidad.
- Ensayo de alto rendimiento, puede procesarse un alto número de muestras de manera simultánea.
- Contras:
- No determina si el anticuerpo puede dar lugar a reactividad cruzada.
WESTERN BLOT (WB)
- Pros:
- Ensayo cualitativo, fácil y sencillo de llevar a cabo.
- Ideal para proteínas desnaturalizadas.
- Contras:
- Difícil de optimizar.
- Requiere mucho tiempo.
- Solo se pueden testar unos pocos anticuerpos al mismo tiempo.
INMUNOHISTOQUÍMICA (IHC) / INMUNOCITOQUÍMICA (ICC)
- Pros:
- Técnicas de relativo bajo coste.
- Ensayo cualitativo.
- Contras:
- Difícil de estandarizar.
- La accesibilidad de los epítopos puede variar en tejidos fijados.
- No determina si el anticuerpo reconoce otras proteínas con la misma localización celular de forma no específica.
CITOMETRÍA DE FLUJO (FC)
- Pros:
- Ensayo de alto rendimiento, puede procesarse un alto número de muestras de manera simultánea.
- Fácil de optimizar.
- Contras:
- No determina si el anticuerpo puede dar lugar a reactividad cruzada.
siRNA KNOCKDOWN
- Pros:
- Las líneas celulares KnockDown se pueden utilizar en todos los ensayos: WB, IHC/ICC , FC…
- Contras:
- El KnockDown es transitorio.
- Difícil de optimizar.
LÍNEAS CELULARES KNOCKOUT (KO)
- Pros:
- Garantizan que no habrá expresión del gen diana, por lo que son inmejorables controles negativos, garantizando la especificidad del anticuerpo.
- Pueden utilizarse en todos los ensayos: WB, IHC/ICC, FC…
- Contras:
- Las líneas celulares KnockOut frente a genes específicos no siempre son viables.
ESPECTROMETRÍA DE MASAS (MS)
- Pros:
- Ensayos de alto rendimiento, puede procesarse un alto número de muestras de manera simultánea.
- Contras:
- Requiere el uso de un espectrómetro de masas y personal cualificado.
- Difícil de optimizar.
Otras consideraciones a tener en cuenta para validar los anticuerpos
1.- La elección y preparación de las líneas celulares o muestras de tejidos, utilizando los correspondientes controles tanto positivos como negativos, y teniendo en cuenta si el anticuerpos reconoce la proteína en su forma nativa o desnaturalizada.
2.- Los protocolos, prestando especial atención y optimizando de forma individualizada los tiempos de incubación (periodos muy cortos pueden afectar a la sensibilidad, y por el contrario, tiempos de incubación excesivos podrían resultar en problemas de ruido de fondo), las diluciones de trabajo, las condiciones de bloqueo, etc.
3.- La elección de los buffers, determinando el óptimo en cada caso.
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