Garantizar la calidad de una muestra de ADN es vital a la hora de realizar un estudio de genética humana. Los procesos de secuenciación y amplificación requieren de muestras libres de contaminación y con un grado de degradación mínimo. Garantizar estas condiciones comienza en el momento de tomar la muestra.
Considerando que secuenciar ADN humano es un proceso que requiere un equipo y personal especializado y cuyo coste puede fácilmente superar los 12.000 euros, hacer una inversión en que las muestras de ADN sean de la máxima calidad es una precaución natural.
Encontrar un equilibrio entre un método de recogida de muestras económico, sencillo, poco invasivo y que de muestras de calidad es uno de los grandes desafíos a los que el campo se ha enfrentado en la última década.
¿Por qué no usar sangre?
Tradicionalmente, se ha recurrido a la sangre para garantizar la calidad de las muestras de ADN en las mismas, ya que se puede asumir con seguridad que no hay contaminación bacteriana en la misma.
Sin embargo, mantener la calidad de una muestra de sangre es un proceso costoso. Transportarlas requiere de un proceso de refrigeración, extraerlas requiere de personal obstétrico especializado, lo cual incrementa notablemente el coste, introduce la posibilidad de que una muestra se deteriore si la cadena de refrigeración se rompe y fuerza a los investigadores a requerir de la colaboración de centros de salud para su extracción.
A lo largo de las últimas dos décadas se ha perfeccionado la tecnología de recolección de muestras de ADN humano mediante la saliva, en lo que ha supuesto una revolución en como se entienden las primeras fases de los estudios de genética humana, especialmente dado su nulo grado de invasividad.
Un cambio de paradigma
El ADN de una muestra de saliva deberá funcionar al menos de forma equivalente al extraído de una muestra de sangre para que siquiera se pueda considerar un cambio de paradigma.
Esto quiere decir que la calidad y cantidad del ADN extraído de la saliva tiene que cumplir con los estándares exigidos a uno aislado de una muestra de sangre, empezando por su origen. Si bien mucha gente asume que el ADN de una muestra de saliva debe pertenecer a células del epitelio bucal, no podrían estar más equivocados.
Múltiples estudios muestran que hasta el 74% (1) del ADN encontrado en las muestras de saliva proviene de glóbulos blancos, una fuente excelente de ADN genómico tanto en calidad como en calidad. Permitiendo extraer prácticamente la misma cantidad de ADN por cada de unidad de volumen con la misma calidad que el material genético de una muestra de sangre, la saliva se puede considerar equivalente a la sangre para aplicaciones genéticas.
Garantizando la calidad de una muestra de adn
El mayor problema al que se enfrentan las muestras de saliva son los enzimas y bacterias que se encuentran naturalmente en la saliva, pudiendo degradar el ADN y deteriorar la calidad de la muestra.
Los kits de recolección de Oragene® y ORAcollect® están diseñados con una combinación de químicos estabilizadores que mantiene la integridad molecular del ADN de la muestra de saliva al inhibir la degradación y prevenir el crecimiento bacteriano.
El tamaño de los fragmentos recolectados mediante estos kits es de más de 23 kb, por lo que la presencia de ADN bacteriano apenas tiene significancia. Cuando se compara con otros métodos de extracción oral, en 2 mL de saliva, Oragene recoge aproximadamente un 11% de ADN bacteriano, substancialmente menos que un enjuague (66%) o el uso de cepillos citológicos (más de un 88%). (2)
Muchos investigadores siguen cuestionando el impacto del contenido bacteriano de la saliva en la secuenciación. La literatura demuestra claramente que cuando se realiza la secuenciación, el contenido bacteriano no tiene ningún impacto en la llamada de variantes. El Dr. Cory McLean de 23andMe® presentó una publicación en la que describía la secuenciación del genoma completo (WGS) de 50 muestras de saliva. El ADN extraído de estas muestras archivadas de Oragene/saliva se secuenció utilizando tecnología Illumina, hasta una profundidad media de 44,9 veces de cobertura y cubriendo entre el 97,8% y el 98,2% del genoma. (3)
Después de identificar las variantes en estas muestras, McLean comparó los resultados con los datos de la misma cohorte determinados previamente mediante una matriz de genotipado. Observó una concordancia de entre el 99,91% y el 99,97%, lo que indica que las muestras de Oragene/saliva proporcionan resultados consistentes en todas las plataformas tecnológicas.
Conclusión
Considerando la creciente importancia que se le da a evitar procedimientos invasivos en el paciente, es evidente que la extracción de sangre se irá relegando a tests donde es indispensable, dejando la recolección de muestras de ADN a métodos menos agresivos y que implican menos complicaciones para el paciente, como la saliva.
En esos casos, recurrir a métodos de recolección de muestras como la saliva es el camino de mínima resistencia, y en estos casos, kits como los de DNA Genotek son los que presentan una mayor garantía de obtener una muestra de la máxima calidad.
Bibliografia
(1) Thiede, C., et al. (2000). Buccal swabs but not mouthwash samples can be used to obtain pretransplant DNA fingerprints from recipients of allogeneic bone marrow transplant. Bone Marrow Transplantation. 25(5):575-577.
(2) James, C., Iwasiow, R.M., Birnboim, H.C. (2011). Human genomic DNA content of saliva samples collected with the Oragene® self-collection kit. DNA Genotek. PD-WP-011.
(3) McLean, C., et al. (2012). Whole-genome sequencing of 50 LRRK2 G2019S carriers discordant for Parkinson’s disease. Presented at the American Society for Human Genomics 2012.
