El proceso de secuenciación masiva comienza con la recolección de muestras biológicas, contemplando desde tejido humano hasta muestras ambientales como suelo, agua, etc. A continuación, encontrarás una descripción general de los pasos involucrados en la recolección de muestras y su preparación para una secuenciación masiva (NGS):
1. Recolección de muestras:
El tipo de muestra recolectada depende de los objetivos específicos de investigación o diagnóstico. Por ejemplo, si el objetivo es estudiar la genética humana, las muestras pueden incluir sangre, saliva, biopsias de tejido o hisopos de diversas superficies corporales. Existen kits específicos para la recolección de muestras no invasivos como los de DNA Genotek, que permiten el almacenamiento de la muestra a temperatura ambiente durante 5 años.
Otro tipo de objetivo de estudio puede ser ambiental, donde las muestras podrían incluir cultivos de suelo, agua, aire o microbios.
2. Preservación y almacenamiento:
Después de la recolección, las muestras deben conservarse adecuadamente para mantener la integridad de los ácidos nucleicos (ADN, ARN) que contienen. Los métodos de conservación varían según el tipo de muestra y la duración prevista del almacenamiento, siendo los más comunes:
- Congelación a temperaturas ultrabajas (-80 °C o menos)
- Almacenamiento en soluciones conservantes (por ejemplo, reactivos de estabilización de ARN)
- Secado de muestras en papeles de filtro especializados.
3. Procesamiento de muestras:
Antes de que pueda ocurrir la extracción de ácido nucleico, es posible que las muestras recolectadas deban someterse a varios pasos de procesamiento para aislar el material objetivo. Por ejemplo, las muestras de sangre pueden requerir la separación del plasma o suero de los componentes celulares, las muestras de tejido pueden requerir homogeneización y las muestras ambientales pueden requerir pasos de filtración o concentración.
4. Extracción de Ácidos Nucleicos:
Una vez procesados, se extraen los ácidos nucleicos (ADN, ARN) de la muestra. Los métodos de extracción varían según el tipo de muestra y la aplicación posterior. Las técnicas de extracción comunes incluyen la extracción con fenol-cloroformo, la purificación en columna basada en membranas de sílice, la purificación basada en perlas magnéticas y la extracción en fase sólida.
5. Control de calidad:
Después de la extracción, la calidad y cantidad de los ácidos nucleicos extraídos se evalúan mediante diversos métodos, como espectrofotometría (p. ej., absorbancia UV) y fluorometría (p. ej., ensayos basados en fluorescencia). Esto garantiza que los ácidos nucleicos extraídos sean adecuados para el análisis y la secuenciación posteriores.
6. Preparación de la biblioteca:
Después de la extracción del ácido nucleico y el control de calidad, el ADN o el ARN se fragmenta en trozos más pequeños y los adaptadores de secuenciación se ligan a los extremos de los fragmentos. Este paso, conocido como preparación de bibliotecas, prepara los ácidos nucleicos para la secuenciación y permite la amplificación de los fragmentos durante el proceso de secuenciación.
7. Secuenciación:
Las bibliotecas preparadas luego se cargan en la plataforma de secuenciación, donde se someten a secuenciación de acuerdo con la tecnología elegida (por ejemplo, Illumina, Ion Torrent, PacBio, Oxford Nanopore). La plataforma de secuenciación genera datos en forma de secuencias de nucleótidos, para su posterior análisis bioinformático.
En general, el proceso desde la recolección de muestras hasta la secuenciación implica numerosos pasos críticos para garantizar la integridad y la calidad de los ácidos nucleicos y la precisión de los datos de secuenciación resultantes. La recolección, preservación, procesamiento y extracción adecuada de muestras es esencial para obtener resultados de secuenciación y biológicos significativos.
