La calidad y la consistencia de los anticuerpos son aspectos imprescindibles si se quieren obtener resultados reproducibles en investigación científica. Y estos aspectos se vuelven especialmente críticos en el caso de utilizar anticuerpos para Citometría de Flujo.
En esta entrada analizamos 3 aspectos clave que han de tenerse en cuenta para asegurarnos de que los anticuerpos para Citometría de Flujo funcionen según lo esperado.
Anticuerpos para Citometría de Flujo: 3 aspectos clave
1.- Titulación
¿Por qué es importante titular los anticuerpos para Citometría de Flujo?
A concentraciones elevadas de anticuerpo, las proteínas diana pueden llegar a saturarse haciendo que el anticuerpo restante se una con baja afinidad a otros antígenos presentes en las células.
Este hecho llevaría a un aumento del ruido de fondo, incrementando la fluorescencia debida a uniones no específicas.
Para evitar esas uniones fuera de rango, se hace imprescindible titular los anticuerpos antes de proceder al ensayo de citometría de flujo. De esta manera se minimiza el ruido debido a las uniones no específicas de los anticuerpos a antígenos de baja afinidad.
En definitiva, se trata de encontrar la concentrar de anticuerpo que ofrezca la señal más brillante junto con el menor ruido de fondo.
¿Cómo titular los anticuerpos para Citometría de Flujo?
La titulación de los anticuerpos para Citometría de flujo debe hacerse bajo las mismas condiciones en las que se llevará a cabo el ensayo, pero con concentraciones variables de anticuerpo.
Lo habitual es realizar una serie de 6-8 diluciones seriadas del anticuerpo que se ensayarán frente a una cantidad conocida de células. Con esos datos se construye una curva estándar que permitirá determinar la concentración a la que se obtiene un mejor ratio señal/ruido.
En esta entrada te contamos con más detalle cómo titular los anticuerpos.
2.- Especificidad
¿Por qué es importante determinar la especificidad de los anticuerpos para Citometría de Flujo?
La especificidad de cada anticuerpo debe validarse para cada técnica en concreto, ya que un mismo anticuerpo podría funcionar perfectamente en un inmunoensayo ELISA y sin embargo no arrojar los resultados esperados en Citometría de Flujo.
En esta entrada ampliamos la información con algunos tips para validar anticuerpos.
¿Cómo determinar la especificidad de los anticuerpos para Citometría de Flujo?
En el caso de la Citometría de Flujo, la validación de la especificidad puede llevarse a cabo mediante distintas vías como por ejemplo la inspección de las células al microscopio una vez marcadas con el anticuerpo o el desarrollo de líneas celulares positivas y negativas mediante técnicas CRISPR o siRNA.
3.- Controles
¿Por qué es importante utilizar controles en Citometría de Flujo?
El uso de controles (especialmente durante la fase del desarrollo del panel) es imprescindible para asegurar que tanto el protocolo como los reactivos estén funcionando como deberían.
¿Qué controles deben utilizarse en Citometría de Flujo?
Algunos de los controles recomendados para Citometría de Flujo son los siguientes:
- Control de viabilidad celular
La presencia de células muertas en la muestra puede dar lugar a artefactos debidos a uniones inespecíficas del anticuerpo, aumentando así los niveles de autoflorescencia.
Existen marcadores (7-AAD, Nuclear Green DCS1, Yoduro de propidio, etc.) que discriminan entre células vivas y muerta, tiñendo únicamente estas últimas.
- Control de superposición espectral
Al llevar a cabo un ensayo de Citometría de Flujo multicolor, el espectro de emisión de varios fluorocromos podría llegar a solaparse.
Este hecho puede corregirse mediante un proceso de compensación, mediante el que se estima dicho solapamiento de espectros, para después sustraerlo de la señal total detectada.
- Control de autofluorescencia
Algunos componentes celulares (por ejemplo el NADPH o las flavinas) son capaces de emitir fluorescencia por si mismos, enmascarando la señal específica del antígeno.
Para detectar la presencia de autofluorescencia en una muestra, se analiza previamente por Citometría de Flujo una alícuota sin marcar.
La autofluorescencia puede corregirse mediante el uso de un láser diferente, o como en el caso anterior, mediante compensación.
- Control de uniones indeseadas del anticuerpo
El anticuerpo podría unirse a epítopos fuera de rango presentes en la muestra que no constituyen el target de interés.
Para subsanarlo, conviene incluir siempre:
– Controles negativos (células que no expresan el antígeno de interés)
– Controles de isotipo (anticuerpo del mismo isotipo que el primario, pero específico de un antígeno no presente en la muestra)
– Controles isoclónicos (anticuerpo sin marcar)
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