Añadir GFP a nuestro experimento de CRISPR nos da la ventaja de poder seleccionar las células mediante fluorescencia, separarlas si disponemos de un citómetro de flujo, y además poder visualizar la función de la proteína según las células se diferencian y dividen.
Crispr/Cas9 GFP es un método ampliamente utilizado en la aplicación de CRISPR para imaging, como método de marcaje, visualización de genes y proteínas, ya que permite integrar el fluoróforo en la célula.
En este post, se describe la utilidad del sistema CRISPR/CAS9 GFP, los conceptos y un protocolo básico a la hora de llevar a cabo un experimento de este tipo.
ABYNTEK BIOPHARMA cuenta con un extenso catálogo y un servicio a medida con productos CRISPR validados por el Broad Institute MIT y Harvard.
Nuestros científicos expertos te asesorarán y guiarán en todo momento para impulsar tu investigación a otro nivel. ¡Contáctanos!
Diseño y síntesis de los componentes CRISPR
Diseño de gRNA
- Descargar la secuencia del gen e identificar la secuencia a impactar.
- Diseñar varios sgRNA: para ello se pueden utilizar diferentes herramientas online; en los siguientes posts del blog de ABYNTEK BIOPHARMA se dan consejos de cómo diseñar de manera eficiente las guías en un experimento CRISPR:
- Diseñar primers de PCR para poder detectar posteriormente las secuencias de los sgRNAs y poder utilizarlos como parte del screening.
Diseño de los Donadores
A la hora de introducir en el ADN celular la secuencia GFP, o además generar una mutación, hay que diseñar los donadores de ADN. Para ello, al igual que en el caso de las guías, hay programas que facilitan la tarea. Las secuencias para genes comunes fluorescentes se encuentran disponibles online y se recomienda la adición de un péptido conector del tag fluorescente a la parte C o N terminal de la proteína. Las secuencias para estos linkers también se encuentran fácilmente online.
Montaje del plásmido
Una vez seleccionado el vector a utilizar en el experimento, hay que llevar a cabo una doble reacción de corte y ligación en el termociclador utilizando la enzima de restricción que corresponda para el plásmido seleccionado, los sgRNAs, donadores y la enzima T4 ligasa para su posterior ligación.
Dependiendo del tipo de vector, es posible adquirir directamente un all-in-one en el que solo se utiliza un vector, que porta toda la información necesaria para el experimento CRISPR-Cas9 (secuencia CAS9, sgRNA, secuencia GFP, secuencias correspondientes a la selección mediante antibióticos…). O, por el contrario, introducir cada elemento en un vector. Los vectores comerciales disponibles, normalmente llevan la información de CAS9, GFP en nuestro caso y resistencias a antibióticos para la posterior selección de los clones positivos.
Producción del vector
Una vez se dispone de toda la información a insertar en las células dentro del vector o vectores, se necesita producirlo en grandes cantidades. Para ello, se trasformarán células competentes que posteriormente produzcan los plásmidos.
Posteriormente, una vez las células producen los plásmidos de manera eficiente, éstos se pueden extraer de las células utilizando un kit de extracción de plásmidos.
Es conveniente secuenciar los plásmidos antes de continuar.
Transfección de la línea celular
El siguiente paso es introducir los vectores dentro de la célula que queremos modificar/marcar. Seguiremos el método correspondiente al tipo de vector que estamos utilizando.
Expansión de clones
Mediante pases celulares se expanden los clones, que se van seleccionando gracias a la resistencia a antibióticos que confieren los plásmidos. Además, gracias a la proteína GFP se pueden seleccionar las células que expresan esta proteína, modificadas gracias a CRISPR, mediante sorting.
También se puede realizar un ensayo endonucleasa, que aportará información sobre el porcentaje de células de la población que ha sido modificado.
Para continuar con la expansión de monoclonales, se hacen diluciones seriadas de manera que un pocillo tendrá la mitad de células que el anterior.
Una vez se han completado los pases para expandir los monoclones, se ha de verificar el genotipo celular.
Por un lado, si las células han sido modificadas correctamente podremos medir la fluorescencia. También debemos comprobar que la información que hemos introducido en la célula ha modificado o no la expresión del gen donde se ha integrado. Para ello, lo primero y más sencillo es realizar una PCR amplificando el lugar de la integración.
Los clones que aparezcan como positivos, posteriormente deberán ser secuenciados para comprobar que la integración se ha producido de manera correcta.
Como hemos visto en este post, la utilidad del sistema CRISPR/CAS9 GFP es indiscutible para la visualización de elementos genómicos en células vivas.
Descubre nuestra amplia gama de productos CRISPR.
ABYNTEK BIOPHARMA pone a tu disposición esta revolucionaria tecnología de edición genética de manera sencilla acompañándote durante todo el proceso. Más información aquí.
